一、 甲基化DNA免疫共沉淀測序概述

甲基化DNA 免疫共沉淀測序（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing， MeDIP-Seq）先用5'-甲基胞嘧啶抗體富集胞嘧啶甲基化的基因組片斷，然后對富集的片段進行高通量測序。該方法檢測范圍覆蓋全基因組，所需測序數(shù)據(jù)量較少，但不能在單堿基分辨率水平上檢測DNA胞嘧啶甲基化狀態(tài)。

二、 甲基化DNA免疫共沉淀測序研究內(nèi)容

• 全基因組不同水平甲基化區(qū)域的分布：分析MeDIP-Seq 讀序在全基因組、不同功能元件區(qū)域（CpG 島、重復(fù)序列、啟動子、非翻譯區(qū)、外顯子、內(nèi)含子和基因間等）的分布情況。識別序列富集峰（peak）。結(jié)果可顯示不同樣本間DNA甲基化修飾模式的差異。
• 基于富集峰的基因功能及其調(diào)控機制的預(yù)測：對于單個樣本，分析與peak相關(guān)的基因；對于多樣本，進行基于peak 的全基因組甲基化差異分析。通過分析差異甲基化區(qū)段（DMR），對差異基因進行GO功能富集分析及pathway功能分析；也可結(jié)合表達譜數(shù)據(jù)，預(yù)測受甲基化調(diào)控的基因。

研究流程示例

三、 甲基化DNA免疫共沉淀測序?qū)嶒灱夹g(shù)路線

MeDIP-Seq實驗流程

四、 樣品要求（基因組DNA）

樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.8～2.0 之間；RNA 應(yīng)去除干凈。
樣品濃度：最低濃度不低于50ng/ul。
樣品總量：每個樣品總量不少于10ug。
樣品溶劑：溶解在H20或TE (pH 8.0)中。
樣品運輸：DNA低溫運輸（-20℃）；且在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污染。

五、 甲基化DNA免疫共沉淀測序數(shù)據(jù)分析流程

六、 MeDIP-Seq數(shù)據(jù)分析內(nèi)容

1. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

包括：總reads數(shù)、總base數(shù)，Q20比例、Q20位點分布圖。

2. 測序數(shù)據(jù)預(yù)處理

包括：去除總體質(zhì)量偏低的reads，將質(zhì)量大于20堿基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端質(zhì)量Q低于20的堿基；去除reads中所含有的接頭序列；去除長度小于20的測序片段(reads)。

3. 將預(yù)處理后的reads比對到參考基因組并統(tǒng)計富集效率

包括：Reads唯一比對率，在CpG島區(qū)域、啟動子區(qū)域及整個基因組的覆蓋及不同深度關(guān)系

4. 測序深度是否足夠質(zhì)量控制

5. 甲基化富集效果質(zhì)量控制

 

6. Peak查找和統(tǒng)計

應(yīng)用MACS軟件對基因組mapping得到的bam文件進行peak 富集區(qū)查找，并統(tǒng)計長度和染色體分布。

7. Peak在CpG島、不同基因功能元件中的分布

  

8. 基于peak的樣本間差異分析

將各樣本有重疊的peak合并，統(tǒng)計每個樣本在合并后的peak中是否富集，統(tǒng)計組間差異的個數(shù)并基于RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads)計算peak在組間差異是否顯著。

9. 樣本間富集程度相關(guān)性分析

 
10. 樣本間差異peak區(qū)域測序深度作圖

 
11. 全基因組甲基化圖譜

 對差異基因進行GO功能富集分析及pathway功能分析

12. 對差異基因進行GO功能富集分析及pathway功能分析

GO功能分析：

 
KEGG功能分析：

 

13. MeDIP-seq數(shù)據(jù)和表達譜數(shù)據(jù)結(jié)合分析

將MeDIP-seq數(shù)據(jù)和表達譜數(shù)據(jù)結(jié)合分析，對富集peak區(qū)域和差異表達基因進行關(guān)聯(lián)，可進行差異基因的甲基化情況聚類熱圖、不同基因區(qū)域甲基化和表達譜相關(guān)性計算和作圖。

14. 客戶定制分析 

可根據(jù)客戶的研究需求，協(xié)商定制個性化分析內(nèi)容。

MeDIP-Sequencing應(yīng)用案例

• PNAS：研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A突變驅(qū)動了慢性粒單核細胞白血病

在20%的急性髓性白血病案例中會發(fā)生DNMT3A的突變，突變熱點為Arg882 (R882)。本研究通過運用逆轉(zhuǎn)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)及骨髓移植（BMT）的方法來研究DNMT3A-Arg882His (R882H)突變體的轉(zhuǎn)化能力。研究人員發(fā)現(xiàn)突變的基因能夠引起造血干細胞/祖細胞的異常增殖。BMT 1年后，所有小鼠都出現(xiàn)了血小板增多，且患上CMML。RNA芯片分析結(jié)果顯示一些造血作用相關(guān)基因異常表達，DNA甲基化實驗證實基因區(qū)域甲基化類型發(fā)生相應(yīng)的變化（課題相關(guān)MeDIP-SEQ技術(shù)服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供）。此外，DNMT3A-R882H增加了CDK1蛋白水平，加強了細胞周期活力，這些都導(dǎo)致白血病的生成。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的陳竺院士、陳賽娟院士以及王月英博士是這篇論文的共同通訊作者。 

原文：DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression/DNA methylation in hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Feb 4.

單位介紹

•        上海伯豪生物技術(shù)有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）是上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心根據(jù)國內(nèi)外研發(fā)外包發(fā)展的需要，整合旗下系統(tǒng)技術(shù)平臺、商業(yè)化服務(wù)體系、高素質(zhì)服務(wù)團隊等資源成立的致力于研發(fā)外包服務(wù)的專業(yè)化公司。

  上海伯豪生物技術(shù)有限公司擁有六大服務(wù)平臺：生物樣品分析平臺、微陣列芯片平臺、新一代測序平臺、生物標(biāo)志物平臺、分子檢測平臺、生物信息平臺，憑借高標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)平臺和多樣化的服務(wù)等競爭優(yōu)勢，公司向國內(nèi)外企業(yè)和相關(guān)單位提供系統(tǒng)的生物學(xué)研究全面解決方案。目前正在為多達18家跨國制藥企業(yè)（包括排名前10位的跨國制藥企業(yè)）和超過3000家的國內(nèi)科研機構(gòu)、醫(yī)院等提供基因表達譜、基因分型、比較基因組學(xué)、DNA甲基化、miRNA、生物標(biāo)志物篩選及確認、生物信息等技術(shù)服務(wù)。 

  公司擁有一支以上海為基礎(chǔ)，輻射全國的強大市場營銷隊伍和銷售網(wǎng)絡(luò)，已設(shè)立華北、華南、華東三個大區(qū)十五個辦事處，推廣公司的主導(dǎo)技術(shù)服務(wù)、代理產(chǎn)品，快速提升公司品牌的知名度，擴大影響力。過去10年承接項目數(shù)超過10000個，用戶單位3000家以上，協(xié)助客戶發(fā)表SCI論文700余篇（影響因子共計3000多分），全面推動了中國基因組學(xué)服務(wù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 

  公司建立了規(guī)?；馁|(zhì)量控制體系，通過了ISO9001: 2008質(zhì)量技術(shù)體系的認證，并參照GLP-L的標(biāo)準(zhǔn)，通過128個SOP文件對項目、樣品、實驗過程、生物信息分析過程、數(shù)據(jù)信息管理、保密等進行嚴(yán)格質(zhì)控。尤其是數(shù)據(jù)管理，做到異地備份，保密管理。為用戶的數(shù)據(jù)真實性、可靠性提供了保證。

  公司的系統(tǒng)化技術(shù)平臺和高質(zhì)量的服務(wù)體系得到了廣大客戶認可和合作伙伴的高度評價。公司平臺陸續(xù)獲得了國際知名高通量技術(shù)廠商Illumina、Affymetrix、Agilent、ABI的技術(shù)服務(wù)中心認證。公司于2012年獲得諾華（CNIBR）優(yōu)秀供應(yīng)商獎（Supplier Award 2012）。公司是Affymetrix公司在中國第一家認證的服務(wù)提供商，是Agilent公司在國內(nèi)唯一認證的服務(wù)提供商，先后被授予“Agilent公司亞太區(qū)最佳服務(wù)供應(yīng)商”和“Affymetrix公司優(yōu)秀服務(wù)商”稱號。

  
  

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